伊丽莎白认为玛丽图谋染指英格兰的王位并对她造成了威胁。此后玛丽被她囚禁了十八年。其中大部分时间，玛丽被软禁在谢菲尔德城堡和谢菲尔德庄园。在乔治塔尔伯特，什鲁斯伯里伯爵六世和他可怕的夫人，哈德威克的贝斯的监视下。
他们的女儿伊丽莎白卡文迪什嫁给了查尔斯斯图亚特（达恩利的兄弟）并育有一女，阿尔贝拉小姐。女王的至爱—–詹姆斯·赫伯恩则被囚禁在了丹麦，患上了“精神病”，最后死于1578年。当时也身陷囹圄，1580年，软禁玛丽的责任被转交到了阿米爱斯伯勒特手中。玛丽在他的“关怀”下度过了余生。
不管如何，1570年，法国国王查理九世派代表劝说伊丽莎白许诺帮助玛丽重新获得她的王位，作为前提条件，玛丽要接受她仍不十分赞同的爱丁堡条约。不过，威廉·塞西尔，一世伯利作为伊丽莎白的代表与玛丽协商。两位女王始终没有见过面。
莱道菲阴谋使得伊丽莎白不得不重新考虑如何处置玛丽。1572年，议会在女王的鼓励下，订立了一道禁止玛丽成为英格兰女王的法案（即“联合合约”），其目的在于预防任何可能在刺杀女王中得益的继位者。这道法案并不是法令，但数以千计的人在上面签字，包括玛丽自己。
伊丽莎白再也不能容忍玛丽，因为她收到许多报告，有人阴谋谋害她本人而让玛丽取而代之（一些历史学家认为这些都是玛丽的敌人伪造的）。
玛丽斯图亚特于1587年2月8日在北安普敦郡佛斯里亨城堡被处极刑，罪名是被怀疑卷入阴谋，贝比通阴谋，企图刺杀伊丽莎白。行刑那天，玛丽身着红色，表明她是一个天主教殉教者。
行刑过程是很残酷的，一些人事后回忆说那天刽子手喝醉之后长喘三口大气才把玛丽的头砍下来，当第一斧头下去，据传她用喉咙喃喃作声说：“刽子手，做完你的事儿！”关于这场行刑有很多其他版本，但经久不衰延续至当代的版本是：当刽子手拿着玛丽面容冷峻的头颅向在场的人展示的时候，这才发现玛丽戴了一个假发头套（戴着假发，就像她平时那样）。她死后的面容难以辨认。
玛丽最初被埋葬在彼得镇大教堂，但是她的遗体于1612年被她的儿子，英格兰国王詹姆士一世挖掘出来了，迁葬到威斯敏斯特教堂。仍在那儿，她的墓穴和她表姑伊丽莎白的只有30英尺（9米）之遥。
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